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在應用ELISA時，首先要清楚下面內容：1，是檢測抗體還是抗原？2，檢測的結果是定性還是定量？3，是否需要檢測特異抗體的類型？4，所用抗體/單克隆抗體的親和力怎樣？
（1）檢測抗原 zui常用于檢測抗原的方法是非競爭性的雙抗體夾心法，其次是競爭法。但競爭法在具體實驗中有些困難，特別是檢測微生物的抗原，因為需要標記抗原，這對于某些抗原是很難做到的，甚至是不可能的。另外在競爭法中，酶標記的抗原與標本直接混合在一起，許多標本中含有酶抑制劑或蛋白A樣物質，可影響ELISA的結果。
（2）檢測抗體 檢測抗體種類常用的方法是檢測抗體種類的捕獲法，這個方法常用于檢測特異性IgG、IgA和IgM.。這個方法的*步是捕獲所需要檢測的一個種類的抗體，接下來是檢測捕獲的抗體是否是特異性抗原的抗體。間接ELISA在檢測IgG時比較簡單，但不適用于檢測其他種類的抗體，因為血清中如果有特異IgG存在將與IgM或IgA等競爭結合抗原。
競爭法檢測抗體有兩種方法：一種是將標記的抗體和標本同時加入反應孔內，但標記的抗體和標本中的抗體必須是結合抗原的不同決定簇；另一種是先加標本，沖洗后再加標記的抗體。競爭法檢測抗體比間接法容易判斷結果，并且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法，ELISA都包括6個步驟：1，抗原或抗體吸附于固相；2.加標本和試劑；3，孵育和沖洗；4，加酶標抗原或抗體；5，加適當的底物；6，檢測和分析結果。
雖然ELISA法在理論上十分簡單，但每一步都有要注意的事項。不論是新設計的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術要點：固相載體的選擇和試劑的制備，反反應條件和操作的標準化。
